9 Macam Identifikasi Protein

Umumnya identifikasi protein yang dilakukan adalah:

            1.  Uji Susunan Elementer Protein

            2.  Uji Kelarutan Protein

            3.  Uji Pengendapan Protein Dengan Garam

            4.  Uji Pengendapan Protein Dengan Logam Dan Asam Organik

            5.  Uji Biuret

            6.  Uji Ninhidrin

            7.  Uji Xantoproteat

            8.  Uji Penentuan Titik Isoelektrik

            9.  Kromatografi Kertas Asam Amino

Pada percobaan yang menggunakan albumin telur, maka yang diambil sebagai sampelnya adalah putih telurnya saja ditambahkan 50 mL akuades.

A.  UJI SUSUNAN ELEMENTER PROTEIN

Semua jenis protein mengandung unsur C, H, O, dan N dan sedikit S dan P, Maka untuk mengetahui unsur yang terkadung didalam protein dilakukan pengujian.

1.  Uji Adanya unsur C, H dan O

• Masukkan 1 mL albumin telur ke dalam cawan porselen lalu tutup dengan kaca obyek di atasnya
• Amati permukaan kaca obyek tersebut, jika ada pengembunan menunjukkan adanya atom H dan O
• Periksalah apakah tercium bau rambut terbakar, jika tercium berarti menunjukkan adanya atom 
• Periksalah apakah ada arang, jika ada berarti menunjukkan adanya atom C

2.  Uji adanya unsur N

• Masukkan 1 mL larutan albumin telur dan 1 mL NaOH 10% ke dalam tabung reaksi lalu panaskan
• Perhatikan bau ammonia yang terjadi, jika tercium menunjukkan adanya unsur N
• Lalu ujilah uapnya dengan kertas lakmus merah yang telah dibasahi akuades

3.  Uji adanya unsur S

• Masukkan 1 mL albumin telur dan 1 mL NaOH 10% lalu panaskan
• Tambahkan 4 tetes larutan Pb-asetat 5%
• Bila larutan menghitam, berarti PbS terbentuk. Kemudian tambahkan 4 tetes HCl pekat
• Jika tercium bau belerang yang khas, menunjukkan adanya unsur S

B.  UJI KELARUTAN PROTEIN

Protein bersifat amfoter, yaitu dapat bereaksi dengan asam dan basa. Kelarutan protein dalam air, asam dan basa berbeda-beda, ada yang mudah larut dan ada juga yang sukar larut. Namun, semua protein tidak larut dalam pelarut lemak seperti eter atau khloroform.

Prosedur pengujian kelarutan protein sebagai berikut:

1. Masukan ke dalam 5 tabung reaksi berturut-turut air suling, HCl 10%, NaOH 40%, alkohol 96% dan kloroform masing-masing sebanyak 1 mL
2. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi tersebut 2 mL albumin telur
3. Kocoklah dengan kuat dan amati kelarutannya

C.  UJI PENGENDAPAN PROTEIN DENGAN GARAM

Protein dapat diendapkan dengan garam berkonsentrasi tinggi. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut salting out. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ion dari garam maka semakin mudah protein diendapkan.

Prosedur pengujian pengendapan protein dengan garam sebagai berikut:

1. Masukan 2 mL albumin telur ke dalam 5 tabung reaksi
2. Masing-masing tabung reaksi bertutut-turut diisi larutan NaCl 1%, BaCl₂ 5%, CaCl₂ 5%, MgSO₄ 5% dan (NH₄)₂SO₄ jenuh setetes demi tetes sampai terbentuk endapan
3. Tambahkan kembali larutan garamnya secara berlebihan
4. Kocok dengan kuat, lalu amati perubahan yang terjadi

D.  UJI PENGENDAPAN PROTEIN DENGAN LOGAM BERAT DAN ASAM ORGANIK

Sebagian besar protein dapat diendapkan dengan penambahan asam-asam organik (seperti asam pikrat, asam trikloroasetat dan asam sulfonat) yang membentuk garam proteinat yang tidak larut.

Protein juga dapat mengalami denaturasi irreversibel akibat penambahan logam-logam berat seperti Cu²⁺, Hg²⁺, atau Pb²⁺.

Untuk mengetahui pengendapan dengan logam berat dan asam organik dapat dilakukan pengujian sebagai berikut:

1. Masukan ke dalam 5 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 2 mL larutan albumin telur
2. Masing-masing tabung berturut-turut ditambahkan 10 tetes larutan asam trikloroasetat 10%, asam sulfosalisilat 5%, CuSO₄ 5%, HgCl₂ 5% dan Pb-asetat 5%
3. Kocoklah setiap tabung dan amati perubahan yang terjadi

E.  UJI BIURET

Uji biuret dilakukan untuk mengetahui adanya ikatan peptida dari protein. Reaksi biuret positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih tetapi negatif untuk asam amino bebas. Reaksi biuret juga positif terhadap senyawa yang mengandung gugus -CH₂NH₂, -CSNH₂, -C(NH)NH₂ dan -CONH₂. Uji biuret positif ditandai dengan terbentuknya senyawa kompleks yang berwarna ungu (violet) akibat dari reaksi ion Cu²⁺ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida penyusun protein.

Prosedur Uji Biuret sebagai berikut:

1. Masukan zat yang diuji sebanyak 2 mL lalu tambahkan 1 mL NaOH 10% dan 3 tetes CuSO₄ 0,2%
2. Campurlah dengan baik dan amati perubahan warna yang terjadi

F.  UJI NINHIDRIN

Uji Ninhidrin dilakukan untuk mengetahui adanya asam amino bebas dalam protein. Uji ninhidrin positif jika terbentuk senyawa kompleks berwarna biru tetapi prolin dan hidroksiprolin menghasilkan senyawa berwarna kuning.

Prosedur Uji Ninhidrin sebagai berikut:

1. Isilah tabung reaksi dengan 2 mL zat yang diuji
2. Tambahkan 5 tetes pereaksi Ninhidrin, lalu panaskan di atas penangas air selama 5 menit
3. Amati perubahan yang terjadi

G.  UJI XANTOPROTEIN

Uji xantoprotein dilakukan untuk membuktikan adanya inti benzena dalam protein. Asam amino yang mempunyai cincin benzena yaitu asam amino tirosin, triptofan dan fenilalanin. Uji ini positif jika membentuk endapan putih ketika ditambahkan asam nitrat pekat dan berubah menjadi kuning sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya berubah menjadi jingga.

Prosedur Uji Xantoproteat:

1. Masukkan 2 mL zat yang diuji ke dalam tabung reaksi
2. Tambahkan 1 mL asam nitrat pekat, perhatikan endapan putih yang terjadi
3. Panaskan selama 1 menit dan amati terbentuknya warna kuning
4. Lalu dinginkan di bawah air kran dan tambahkan NaOH 10% setetes demi tetes melalui dinding tabung hingga terbentuk lapisan
5. Perhatikan perubahan warna yang terjadi

H.  UJI PENENTUAN TITIK ISOELEKTRIK

Titik isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama sehingga tidak bergerak bila diletakkan dalam medan listrik. Protein mempunyai titik isoelektrik berbeda-beda dan pada pH isoelektrik, daya kelarutan protein minimal sehingga menyebabkan protein mengendap. 

Prosedur penentuan titik isoelektrik sebagai berikut:

1. Lima tabung reaksi diisi masing-masing 1 mL larutan kasein
2. Pada setiap tabung ditambahkan 1 mL larutan buffer asetat masing-masing dari pH 3,8; 4,7; 5,0; 5,3 dan 5,9
3. Kocok campuran dengan baik dan catat derajat kekeruhannya setelah 0, 10, dan 30 menit
4. Perhatikan hasilnya, pada tabung berapa terbentuk endapan maksimal
5. Lalu panaskan semua tabung di atas penangas air
6. Amati hasilnya, pembentukan endapan kekeruhan paling cepat atau paling banyak merupakan titik isoelektrik kasein. 

I.  KROMATOGRAFI KERTAS ASAM AMINO

Salahsatu cara untuk mengidentifikasi protein adalah menggunakan metode kromatografi kertas. Adapun proses pengujiannya sebagai berikut:

1. Sediakan bejana kromatografi (20 x 20 cm), kemudian isilah dengan fase bergerak (pelarut) yang terdiri dari n-butanol; asam asetat; air (4:1:5) setinggi kira-kira 1 cm dari dasarnya. Tutuplah bejana, lalu biarkan pelarut mencapai kesetimbangannya selama 10 menit.
2. Ambil kertas whatman No. 1 (20 x 10 cm) kemudian tandai garis batas dengan pensil pada jarak 3 cm dari ujung bawah.
3. Beri tanda (.) pada garis batas sebanyak 3 buah dengan jarak antar titik 2,5 cm
4. Totolkan zat uji (misalnya alanin, tirosin dan lisin)  5-50 mikrogram menggunakan pipa kapiler pada titik A = Alanin, T = Tirosin, L = Lisin. Biarkan beberapa saat hingga noda mengering
5. Masukkan kertas ke dalam bejana sebagai ruang kromatografi yang berisi pelarut dengan jalan digantungkan pada bagian atas sedemikian rupa sehingga bagian bawah tercelup pelarut
6. Biarkan pelarut naik melalui serat-serat kertas sampai batas tertentu, kira-kira 1 cm di bagian atas kertas
7. Keluarkan kertas, lalu keringkan dengan udara terbuka atau menggunakan kipas angin
8. Selanjutnya semprot dengan pereaksi ninhidrin 0,5% dan keringkan pada suhu 100°C selama +/- 5 menit
9. Hitunglah harga Rf masing-masing zat

Daftar Pustaka:

Estien Yazid, Lisda Nursati, Penuntun Praktikum Biokimia, CV Andi Offset, Yogyakarta, 2006